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甲型肝炎病毒染料法荧光定量RT-PCR试剂盒说明书

提供者:上海彩佑实业有限公司   发布时间:2019/8/22  阅读次数:48次   进入该公司展台

 

    甲型肝炎病毒染料法荧光定量RT-PCR试剂盒

     

    中英文名称

    规格

    价格

    说明书

    Hepatitis A Virus(HAV)

    甲型肝炎病毒染料法荧光定量RT-PCR试剂盒

    50

    2990

     

    运输:低温

    保存:负20

    有效期:一年

    货期:2-3

    产品及特点

    1. 即开即用,用户只需要提供病毒样品。

    2. 根据甲型肝炎病毒染料法荧光定量RT-保守序列设计的专一性引物,与相关病毒无交叉反应。

    3. 灵敏度可以达到几百拷贝/反应。

    4. 一管式荧光定量PCR检测,避免后续污染。

    5. 本试剂盒足够5020μL反应体系的荧光定量PCR

    本产品只适用于科研,不能用于临床诊断。

    规格及成分

    成分

    编号

    十孔盒包装

    2×qPCR MagicMix

    试剂一

    500μL(棕色管)

    荧光PCR专用模板稀释液

    试剂二

    1 mL(黄盖)

    甲型肝炎病毒染料法荧光定量RT-PCR引物混合物

    试剂三

    100μL(白盖)

    甲型肝炎病毒染料法荧光定量RT-PCR阳性对照

    (1×10E8 拷贝/μL)

    试剂四

    50μL(红盖)

    使用手册

    试剂五

    1

    运输及保存

    低温运输,-20℃保存,保存期限一年

    自备试剂 

    DNA模板、10×ROX(根据机型决定,具体见使用方法)。

    使用方法

    、稀释PCR阳性对照(以10E2-10E7拷贝/μL610倍稀释度为例)

    1. 注意:由于标准品浓度非常高,因此下列稀释操作一定要在独立的区域进行,千万不能污染样品或本试剂盒的其他成分)。为增加产品稳定性和避免扩散传染性病原,本产品不提供活体样品做阳性对照,只提供可以直接使用的DNA片段作为阳性对照。

    2. 标记6个离心管,分别为765432

    3. 用带芯枪头分别加入45 μL荧光PCR专用模板稀释液(用带芯枪头,下同)。

    4. 7号管中加入5 μL 1×10E8拷贝/μL 的阳性对照,充分震荡1分钟,得1×10E7拷贝/μL的阳性对照。放冰上待用。

    5. 换枪头,在6号管中加入5 μL 1×10E7拷贝/μL 的阳性对照(上步稀释所得),充分震荡1分钟,得1×10E6拷贝/μL的阳性对照。放冰上待用。

    6. 换枪头,在5号管中加入5 μL 1×10E6拷贝/μL的阳性对照到5号管中,充分震荡1分钟,得1×10E5拷贝/μL的阳性对照。放冰上待用。

    7. 重复上面的操作直到得到6个稀释度的阳性对照。放冰上待用。

    二、样品DNA的制备

    8. 如果有N个样品,必须设置N+2个提取,多出的一个是PC(样品制备阳性对照),一个是NC(样品制备阴性对照)。可以用10μL上步制备的PCR阳性对照的第4号(浓度为1×10E4 拷贝/μL10μL相当于1万拷贝)或第5号(浓度为1×10E5 拷贝/μL10μL相当于10万拷贝)再加上一定量的水使总体积跟每次制备要求的体积一样,以此作为PC。另外用水作为NC。如果每次制备需要200μL样品,则PCNC的体积也必须是200μL

    9. 用自选方法纯化样品的DNA,本试剂盒跟市场上大多数病毒DNA提取试剂盒兼容。

    三、设置qPCR反应(20 μL体系,在样品制备室进行)

    10. 如果只做1次重复,则标记N+9PCR管,其中N+2个用于上步得到的N+2个样品,1个用于PCR阴性对照,6个用于PCR阳性对照。如果做2-3次重复,则反应设置数量相应增加23倍。

    11. 在标记管中按下表加入各成分(本表只列出一次重复。样品管和阴性对照设置完毕后才设置阳性对照,并且阳性对照样品要等所有管子盖上盖子储存好后加):

    成分

    样品管

    N+2

    PCR阴性对照管

    PCR阳性

    对照管(2-7管)

    2×qPCR MagicMix

    (棕色管)

    10 μL

    10 μL

    10 μL

    甲型肝炎病毒染料法荧光定量RT-PCR

    引物混合液(白盖)

    2 μL

    2 μL

    2 μL

    自备10×ROX (见注)

    2 μL

    2 μL

    2 μL

     N+2待测样品DNA模板

    6 μL

    不加

    不加

    7步所得PCR阳性对照

    稀释液(2-7号)

    不加

    不加

    6μL2号样到2号管,3号样到3号管

    :ABI750077007900仪器需要使用ROX作为对照,其他荧光PCR仪器(如iCycler IQMJ OptionMJ Chromo4MX3000MX4000RotorGene 3000RotorGene 6000LightCycler480)不需要使用ROX,则用水替代。

    12. 盖上盖子后上机,按下面参数进行PCR(具体PCR参数可以根据仪器不同而自行优化)。

    过程

    温度

    时间

    预变性

    92℃

    5分钟

    PCR反应

    30个循环)

    92℃

    60 

    54℃

    60 

    72℃

    60 

    13. 数据采集

    具体操作按所用仪器推荐的流程进行。本产品中所含的荧光染料在不结合DNA时,大吸收光谱在471 nm,结合DNA时的大吸收光谱在500 nm,大发射光谱在530 nm。信号采集可以设置在复性或延伸步骤。 

    四、数据处理

    14. 如果把本试剂盒用于定量检测,则以阳性对照浓度的log值为横轴,以Ct值为纵轴,绘制标准曲线。再以待测样品的Ct值从标准曲线上推算出样品DNA浓度的log值,再推算出其浓度。

    如果把本试剂盒用于定性检测,只判断阳性或阴性,则阴性对照Ct必须大于或等于40。阳性对照必须有荧光对数增长,有典型扩增曲线,Ct值应该小于或等于30。对待测样品,如果其Ct大于或等于40则为阴性,如果小于或等于35则为阳性。如果在35-40之间,则重复一次。重复实验的Ct值如果大于或等于40则为阴性,如果小于40,则为阳性。

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